Изменение длины теломер хромосом при воздействии климатических условий, имитирующих жару в Москве летом 2010 года №02 2013

Кардиология Кардиологический вестник - Изменение длины теломер хромосом при воздействии климатических условий, имитирующих жару в Москве летом 2010 года

Для цитированияСкрыть список
Н.А.Дорощук, А.Д.Дорощук, О.В.Родненков, М.К.Осяева, З.Б.Хасанова, Ю.Д.Хесуани, А.Ю.Постнов, И.Е.Чазова. Изменение длины теломер хромосом при воздействии климатических условий, имитирующих жару в Москве летом 2010 года. Кардиологический вестник (архив 2006-2013 гг.). 2013; 02: 
Резюме
Цель исследования. Изучить состояние теломерных повторов хромосом у жителей Москвы и влияние неблагоприятных погодных условий (имитирующих условия жары 2010 г. в Москве) на теломеры хромосом в лейкоцитах периферической крови.
Материалы и методы. ДНК, выделенная из периферической крови жителей Западного округа Москвы и из крови 6 добровольцев, находившихся в изолированном помещении, где были воспроизведены условия жары 2010 г. в Москве. Относительную длину теломер (ОДТ) измеряли на приборе для полимеразной цепной реакции в реальном времени. Математический расчет ОДТ производился по разработанной методике.
Результаты. Разработан метод математического расчета ОДТ. Определена относительная норма длины теломерных повторов для жителей Западного округа г. Москвы.
Заключение. Показано достоверное уменьшение ОДТ на 16,5% у лиц, находящихся в условиях гипертермии, а также при повышенном содержании СО.
Ключевые слова: относительная длина теломер,  ДНК, ПЦР в реальном времени.

Сhange in length of telomeres of the chromosomes under the influence
of the climatic conditions that simulate hot weather at Moscow in summer 2010

N.A.Doroshuk, A.D.Doroshuk, O.V.Rodnenkov, M.K.Osyaeva, Z.B.Hasanova, Yu.D.Hesuani, A.Yu.Postnov, I.E.Chazova

Summary
The purpose of the study. To examine the state of telomeric repeats in chromosomes in Moscow and the impact of adverse weather conditions (simulating the conditions of heat, 2010 in Moscow) at the telomeres of chromosomes in peripheral blood leukocytes.
Materials and methods. DNA isolated from the peripheral blood of the inhabitants of Moscow and from the blood of six volunteers were in a separate room, where the heat conditions were reproduced in 2010 in Moscow. The relative telomere length was measured on the device in real-time PCR. Mathematical calculation of the relative telomere length was produced by the developed method.
Results. Developed a method for the mathematical calculation of relative telomere length. Defined relative norm length of telomeric repeats for residents of the Western District of Moscow.
Conclusion. Demonstrated a significant decrease in the relative telomere length is 16,5% of individuals in situations of hyperthermia, as well as elevated levels of CO.
Key words: the relative length of telomeres, DNA, real-time PCR.

Сведения об авторах
Дорощук Наталья Александровна – врач-лаборант кабинета медицинской генетики ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России. E-mail: natador28@mail.ru
Дорощук Александр Дмитриевич – канд. биол. наук, науч. сотр. лаб. медицинской генетики ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России
Родненков Олег Владимирович – канд. мед. наук, ст. науч. сотр. отд. хронической ишемической болезни сердца ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России
Осяева Мария Константиновна – лаборант-исследователь отд. хронической ишемической болезни сердца ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России
Хасанова Зухра Биляловна – мл. науч. сотр. лаб. медицинской генетики ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России
Хесуани Юсеф Джоржевич – лаборант-исследователь лаб. биохимии свободнорадикальных процессов ИКК
им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России
Постнов Антон Ювенальевич – д-р мед. наук, рук. отд. сердечно-сосудистой патологии ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России. E-mail: anton-5@mail.ru
Чазова Ирина Евгеньевна – д-р мед. наук, проф., чл.-кор. РАМН, дир. ИКК им. А.Л.Мясникова ФГБУ РКНПК Минздрава России

Теломеры – специализированные ДНК-белковые структуры на концах линейных отделов хромосом. Теломерная ДНК человека и всех млекопитающих, рептилий, амфибий, птиц и рыб представлена многократным TTAGGG-повтором. Теломеры в клетке выполняют несколько функций. Одна из самых важных – это решение проблемы концевой недорепликации ДНК. Отстающая цепь репликативной вилки в синтезе ДНК не может синтезироваться до 5'-конца в отсутствие рибопраймера, который, в свою очередь, не образуется непосредственно на концевом фрагменте. Потери концевой ДНК делают невозможной бесконечную пролиферацию. Предполагают, что укорачивание хромосом до определенного размера индуцирует процессы клеточного старения, а длина теломер (по этим представлениям) может служить мерой пролиферативного потенциала клеток. Теломеры также играют важную роль в создании специфической архитектуры и внутренней упорядоченности клеточного ядра.
Важная характеристика теломерной ДНК – ее длина. У человека она составляет 2–20 тыс. пар оснований, в лейкоцитах периферической крови – 5–12. Длина теломерной ДНК не является постоянной величиной. С каждым клеточным делением она уменьшается на 50–200 нуклеотидов [1]. Связано это с неполной репликацией 5’-конца хромосомы [2, 3]. Значительное укорочение теломерной ДНК приводит к тому, что клетка перестает делиться и умирает. А скорость укорочения теломер напрямую влияет на скорость старения в целом.
Ранее в некоторых работах была показана корреляция между длиной теломер и старением как клеточной культуры, так и целого организма [4, 5]. Точная оценка биологического возраста человека, представляющая интерес как для антропологических, так и для криминалистических исследований, сопряжена с большими методическими сложностями [6]. Не только абсолютное значение, но и распределение длин теломер в клеточных популяциях периферической крови может стать информативным маркером для этих целей. На данный момент известен целый ряд заболеваний, при которых происходит ускоренное укорочение теломер в клетках разных тканей [7].

Материалы и методы
В работе использовали ДНК, выделенную из лимфоцитов периферической крови. При взятии крови использовали вакутейнеры, содержащие антикоагулянт этилендиаминтетраацетат (ЭДТА). ДНК выделяли с использованием набора 6-1-2.jpgдля выделения ДНК «ДНК-Экстран-1» (ЗАО «Синтол», Россия).
Полученные образцы ДНК доводили до концентрации 2 нг/мкл. Измерение концентрации проводили при помощи нанофотометра IMPLEN (Германия). Для данного метода необходимо предельно точно определять концентрацию выделенной ДНК и затем доводить до нужной концентрации. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 20 нг ДНК, 10 мкл смеси SIBRGreen, по 1 мкл праймеров telg, telc, albu, albd – концентрация 900 нМ каждого (см. таблицу). Полученную смесь доводили до объема 25 мкл деионизированной водой. Таким образом, реакционная смесь для каждого образца содержала как праймеры для теломерной ДНК, так и праймеры для гена альбумина. Причем температура гибридизации праймеров к теломерным повторам составляла 74°С, а температура гибридизации праймеров к альбумину составляла 84°С. Альбумин служил внутренним контролем, относительно которого определяли длину теломерного повтора. В качестве отрицательного контроля мы использовали реакционную смесь, не содержащую ДНК, с двумя парами праймеров, а также реакционную смесь, содержащую только специфические праймеры для гена альбумина.
Амплификацию в реальном времени проводили на приборе АНК-32 (Россия) в следующем режиме [8]: денатурация ДНК – 15 мин при 95°С; синтез синтетической матрицы теломерного повтора – 2 цикла 15 с 94°С, 15 с 49°С; амплификация теломерного повтора и гена альбумина – 50 циклов 15 с 94°С, 10 с 62°С, 15 с 74°С, 10 с 84°С, 15 с 88°С (рис. 1).Кривые накопления продукта, полученные в процессе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени, были подвергнуты математической обработке. Для этого нами был разработан метод математической обработки данных, который ранее не был описан в литературе.
Показания уровня флюоресценции для теломер снимались при температуре 74°С, а для альбумина – при температуре 88°С. Для этого, перейдя в режим ручной обработки данных, мы снимали показания уровня флюоресценции для всех точек всех циклов. Далее эти значения переносили в программу Microsoft Office Excel и выделяли те показания флюоресценции, которые соответствовали температуре 74°С для теломер и 88°С – для альбумина. На основании полученных показаний мы строили две кривые роста уровня флюоресценции для теломер и для альбумина отдельно (рис. 2). Полученные данные использовали для построения логарифмичес6-3.jpgких прямых, расстояние между которыми определялось как dСТ (рис. 3). Относительную длину теломер (ОДТ) вычисляли по формуле: 2 dСТ. В качестве калибратора использовали ДНК, выделенную из крови 10-летнего ребенка. Конечным результатом обработки являлся процент величины ОДТ от калибратора.
В ходе работы была определена ОДТ 378 человек в возрасте 18–75 лет, жителей Западного округа Москвы. Исследуемая группа включила в себя 141 мужчину и 237 женщин. Средний возраст составил 51 год. Определение ОДТ проводили 3 раза для каждого образца ДНК. Для образцов, в которых при сравнении значений ОДТ для трех повторов разброс величин превышал 10%, эксперимент проводили заново.
Производили также замер ОДТ для 6 добровольцев, мужчин в возрасте 22–46 лет, которые находились в течение 30 дней на изолированной базе медико-технического комплекса Института биологических проблем РАН при искусственно созданных климатических условиях, моделирующих погоду лета 2010 г. в Москве. Температура окружающей среды составляла от 30 до 38°С в дневное время и 23–31°С в ночное время при влажности до 75% и уровне СО от 5 до 40 мг/м3. Взятие крови производили у испытуемых в вакутейнеры, содержащие антикоагулянт ЭДТА за 2 мес до начала исследования, а также в момент начала и окончания данного исследования.
Результаты исследования
Воспроизводимость методики была высокой (рис. 4). На рис. 4 видно практически полное совпадение кривых рос6-4-5-6.jpgта флюоресценции для каждого человека. Получена отрицательная корреляция между ОДТ и возрастом (рис. 5), что согласуется с данными литературы [9, 10]. Данная закономерность была обнаружена в исследуемой выборке как у мужчин, так и у женщин. Средняя длина теломер в лейкоцитах периферической крови жителей Москвы – 71,15%.
У мужчин средняя ОДТ оказалась несколько ниже, чем у женщин, и составила 69,2%. У женщин средняя ОДТ была равна 73,1%. В возрастной группе москвичей 20–45 лет ОДТ в лейкоцитах периферической крови составила 74,8%. В старшей возрастной группе (45–75 лет) средняя ОДТ составила 67,5%.
ОДТ лейкоцитов периферической крови 6 участников климатического исследования за 2 мес до начала испытания и на момент начала испытания были практически равны и составили 81,7 и 81% соответственно. После пребывания испытуемых в экстремальных климатических условиях в течение 30 дней произошло достоверное снижение ОДТ в лейкоцитах периферической крови на 16,5% (р<0,02); рис. 6. Если до начала исследования показатели ОДТ соответствовали средним возрастным показателям, то после окончания исследования эти значения снизились до нижних границ средних возрастных показателей и стали соответствовать средним значениям старшей возрастной группы.

ОбсуждениеПолученные данные однозначно показывают влияние экстремальных климатических условий на ОДТ лейкоцитов периферической крови. Однако в настоящее время невозможно сказать, какие именно климатические изменения столь сильно влияют на значения ОДТ. Данные этого, во многом пилотного, проекта требуют дальнейшего исследования в лабораторных условиях на экспериментальных животных. Объяснить такие изменения в длине теломерных повторов только делением клеток невозможно. Скорее всего, они связаны с деградацией ДНК в результате воздействия окислительного стресса, развившегося в результате неблагоприятных воздействий факторов окружающей среды.
На сегодняшний день определение длины теломер с помощью метода ПЦР в реальном времени получило широкое распространение. Это связано с удобством и простотой данного метода. Такой метод определения длины теломер, как Саузерн-блот, является более точным по сравнению с ПЦР в реальном времени. Однако этот метод более трудоемкий и медленный. Существует также метод гибридизации in situ для определения длины теломер. Данный метод весьма трудоемкий, а также требует специальной пробоподготовки. Ранее была показана корреляция длины теломер, полученных разными способами [11]. Для определения длины теломер в большой выборке удобнее пользоваться методом ПЦР в реальном времени. Данный метод позволяет дешево, быстро и достаточно точно получить результаты.
Значения длин теломер, полученные в лейкоцитах периферической крови, могут не отражать истинную длину теломер в слабопролиферирующих тканях, таких как мозг или печень. Для подтверждения данной взаимозависимости требуются дополнительные исследования на экспериментальных животных.
Список исп. литературыСкрыть список
1. Harley CB, Futcher AB, Greider CW. Telomeresshorten during ageing of human fibroblasts. Nature 1990; 345: 458–60.
2. Оловников А.М. Принцип маргинотомии в матричном синтезе полинуклеотидов. Докл. Акад. наук. 1971; 201: 1496–9.
3. Watson JD. Origin of concatameric T4 DNA. Nature 1972; 239: 197–201.
4. Tsuji A, Ishiko A, Takasaki T, Ikeda N. Estimating age of humans based on telomere shortening. Forensic Sci Int 2002; 126: 197–9.
5. Cawthon RM et al. Association between telomere length in blood and mortality in people aged 60 years or older. Lancet 2003; 361: 393–95.
6. Johnson TE. Recent results: Biomarkers of aging. Expl Gerontol 2006; 41: 1243–6.
7. Lansdorp PM. Telomeres and disease. EMBO J 2009; 28 (17): 2532–40.
8. Cawthon RM. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res 2009; 37 (3): e21.
9. Oeseburg H, de Boer RA, van Gilst WH, van der Harst P. Telomere biology in healthy aging and disease. Pflugers Arch Eur J Physiol 2010; 459: 259–68.
10. Joeng KS, Song EJ, Lee K-J, Lee J. Long lifespan in worms with long telomeric DNA. Nature genetics 2004; 36 (3); 607–11.
11. Aviv A, Hunt SC, Lin Jet et al. Impartial comparative analysis of measurement of leukocyte telomere length. DNA content by Southern blots and qPCR. Nucleic Acids Res 2011; 39: e134.
12. Titiade Lange. Shelterin: the protein complex that shapes and safeguards human telomeres. Genes Dev 2005; 19: 2100–10.
13. Callaghan NJ, Fenech M. A quantitative PCR method for measuring absolute telomere length. Biol Proced Online 2011; 13: 3.
В избранное 0
Количество просмотров: 766
Предыдущая статьяВлияние компонентов окислительно-восстановительного взаимодействия на сравнительный фибринолиз фибринового сгустка в модельной системе in vitro
Следующая статьяТонус вегетативной нервной системы человека при разном содержании оксида углерода в атмосфере