Исследование факторов персистенции: биопленкообразующей способности и антилизоцимной активности этиологических агентов хронического остеомиелита №02 2014

Хирургия и интенсивная терапия Инфекции в хирургии - Исследование факторов персистенции: биопленкообразующей способности и антилизоцимной активности этиологических агентов хронического остеомиелита

Для цитированияСкрыть список
И.В.Шипицына, Е.В.Осипова, З.С.Науменко. Исследование факторов персистенции: биопленкообразующей способности и антилизоцимной активности этиологических агентов хронического остеомиелита. Инфекции в хирургии. 2014; 2: 
Резюме. Исследовано 159 клинических штаммов бактерий, принадлежащих к 5 таксонам, выделенных у 123 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей из гнойных ран, свищей в дооперационном периоде и очага воспаления во время операции. Результаты фотометрического исследования показали варьирование количественного значения антилизоцимного признака в пределах вида. Высокий уровень антилизоцимной активности преобладал у среднеадгезивных штаммов. Все штаммы микроорганизмов, выделенные из остеомиелитического очага, были способны образовывать биопленку с разной степенью интенсивности. Среди штаммов бактерий, выделенных у пациентов с хроническим остеомиелитом, наибольшим патогенным потенциалом обладали штаммы Pseudomonas аeruginosa.
Ключевые слова: биопленка, адгезия, антилизоцимная активность, хронический остеомиелит.

Studying the factors of persistence: biofilm-forming ability and anti-lysozyme activity of chronic osteomyelitis etiological agents

I.V.Shipitsyna, E.V.Osipova, Z.S.Naumenko
Ilizarov Russian Scientific Center for Restorative Traumatology and Orthopaedics of the Ministry of Health
of the Russian Federation, Kurgan

Summary. 159 clinical strains of bacteria belonging to 5 taxons examined. The strains isolated in 123 patients with chronic osteomyelitis of long tubular bones from purulent wounds, fistulas in the preoperative period, as well as from the inflammation focus during surgery. The results of photometric study have demonstrated the variation of anti-lysozyme sign quantitative value within species. Anti-lysozyme activity of high level prevailed in strains of average adhesiveness. All the strains of microorganisms isolated from osteomyelitic focus were able to form biofilm with intensity of different degree. Pseudomonas аeruginosa strains had the greatest pathogenic potential among the bacterial strains isolated in patients with chronic osteomyelitis.
Key words: biofilm, adhesion, anti-lysozyme activity, chronic osteomyelitis.

Сведения об авторах
Шипицына Ирина Владимировна – канд. биол. наук, науч. сотр. науч.-клин. лаб. микробиологии и иммунологии ФГБУ РНЦ Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А.Илизарова E-mail: ivschimik@mail.ru
Осипова Елена Владимировна – канд. биол. наук, ст. науч. сотр. науч.-клин. лаб. микробиологии и иммунологии ФГБУ РНЦ Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А.Илизарова E-mail: e-v-osipova@mail.ru
Науменко Зинаида Степановна – канд. биол. наук, зав. науч.-клин. лаб. микробиологии и иммунологии ФГБУ РНЦ Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А.Илизарова

Введение

Хронический остеомиелит длинных трубчатых костей относится к одной из сложных и актуальных проблем гнойной хирургии. Одна из причин возникновения хронического инфекционного процесса – способность бактерий к образованию биопленок, за счет чего многократно повышается их устойчивость к антимикробным препаратам и факторам иммунной защиты макроорганизма [1, 2]. Устойчивость бактерий в инфицированных ранах ко многим антибактериальным препаратам связана в первую очередь со свойствами клеток-персистеров и внеклеточного матрикса, образующих биопленку [3, 4]. Способность матрикса активно связывать и замедлять диффузию антибиотиков сквозь биопленку приводит к неполной эрадикации микроорганизмов, что в свою очередь способствует их выживанию и формированию хронических процессов [5, 6]. Микроорганизмы, заключенные в биопленку, обладают набором свойств, направленных на инактивацию факторов иммунной защиты макроорганизма [7, 8]. К числу таких признаков относят способность связывать лизоцим, индуцировать интерферон, разрушать иммуноглобулины, угнетать фагоцитоз и др. Изучение персистентных свойств микроорганизмов необходимо в понимании патогенеза воспалительных заболеваний. Выявление антилизоцимной, антииммуноглобулиновой, антикомплементарной активностей, адгезивной и биопленкообразующей способностей и разработка новых методических приемов по их определению будут способствовать направленному поиску путей управления этими информационными признаками патогенов через их регуляцию при помощи физических, химических и биологических факторов.
Цель работы – изучение антилизоцимной активности (АЛА) и адгезивных характеристик этиологических агентов хронического остеомиелита.

Материалы и методы

Исследовано 159 клинических штаммов бактерий, принадлежащих к 5 таксонам (Staphylococcus aureus – 89; Staphylococcus epidermidis – 23; Enterococcus spp. – 13, Enterobacteriaceae spp. – 12; Pseudomonas aeruginosa – 19; Serratia marcescens – 3), выделенных у 123 пациентов с хроническим остеомиелитом длинных трубчатых костей из гнойных ран, свищей в дооперационном периоде и очага воспаления во время операции. Идентификацию исследуемых штаммов проводили на бактериологическом анализаторе WalkAway-40 Plus (Siemens, США). Адгезивную активность штаммов изучали на модели эритроцитов человека А(ІI) Rh+ по методике В.И.Брилиса [9]. При оценке адгезивных свойств использовали показатели: средний показатель адгезии (СПА), коэффициент адгезии, индекс адгезивности микроорганизмов (ИАМ). Исследование проводили под световым микроскопом, учитывая в общей сложности не менее 50 эритроцитов. Микроорганизмы считали неадгезивными при ИАМ – до 1,75; низкоадгезивными – от 1,76 до 2,5; среднеадгезивными – от 2,51 до 4,0; высокоадгезивными – 4,1 и более. АЛА изучаемых штаммов определяли фотометрическим методом [10]. Изучение способности выделенных штаммов формировать биопленки на поверхности 96-луночных полистироловых планшетов проводили по методу G.Toole и R.Kolter [11]. По уровню адсорбции красителя этанолом, измеренному в единицах оптической плотности (OD630) на фотометре ELx808 (BioTek, США) при длине волны 630 нм, оценивали активность формирования биопленки. Для интерпретации полученных данных определяли способность штаммов формировать биопленки в соответствии с критериями, разработанными S.Stepanovic и соавт. [12]: при значениях OD630<0,090 считали, что штаммы не обладали способностью к образованию биопленки; при 0,090<ODпл≤0,180 – имели слабую способность к образованию биопленки; при 0,180<ODпл≤0,360 – среднюю; при ODпл>0,360 – высокую.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения анализа данных AtteStat, версия 13,0 [13]. Значимость различий между группами проверяли с помощью непараметрических критериев Вилкоксона–Манна–Уитни. Различия между группами наблюдений считались статистически значимыми при р<0,05.

Результаты и обсуждение

Среди грамположительных микроорганизмов АЛА обладали 46,2% изолятов Enterococcus spp., 58,4% штаммов S. aureus, 60,8% штаммов S. epidermidis. В группе грамотрицательных микроорганизмов АЛА обладали 50% штаммов Enterobacteriaceae spp., 84,2% штаммов P. aeruginosa, все штаммы S. marcescens.
Анализ результатов показал варьирование количественного значения этого признака в пределах вида. Так, например, у штаммов S. aureus интенсивность АЛА изменялась от 0,06 до 1,01 мкг/мл ед. опт. пл. Антилизоцимный признак штаммов P. аeruginosa варьировал в пределах от 0,12±0,03 до 0,64±0,12 мкг/мл ед. опт. пл. Высокий уровень АЛА был отмечен у штаммов S. marcescens (n=3), P. аeruginosa (n=4), S. aureus (n=13). Также высокий уровень АЛА преобладал у среднеадгезивных штаммов.
В целом доминировали штаммы с умеренной АЛА, за исключением штаммов S. marcescens (рис. 1). 9-r1.jpg
В группе грамположительных микроорганизмов СПА изменялся в пределах от 1,88±0,14 ед. (S. epidermidis) до 1,99±0,08 ед. (S. aureus). Коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе составил 95%. ИАМ варьировал в пределах от 1,97±0,14 ед. у штаммов S. epidermidis до 2,13±0,19 ед. – у штаммов Enterococcus spp. Среднеадгезивными свойствами обладали 21% штаммов S. aureus, 17,4% штаммов S. epidermidis, 23,1% штаммов Enterococcus spp.
В группе грамотрицательных микроорганизмов СПА изменялся в пределах от 2,04±0,18 ед. у штаммов Enterobacteriaceae spp. до 2,65±0,16 ед. у штаммов P. aeruginosa. СПА штаммов S. marcescens составил 3,10±0,24 ед. Коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе составил 98%. ИАМ изменялся от 2,13±0,19 ед. у штаммов Enterobacteriaceae spp. до 3,21±0,93 ед. у штаммов S. marcescens. Среднеадгезивными свойствами обладали 25% штаммов Enterobacteriaceae spp., 84,2% штаммов P. aeruginosa.
Анализ результатов фотометрического исследования показал, что все эти штаммы микроорганизмов способны формировать биопленку. Среди этиологических агентов хронического остеомиелита высокой способностью к образованию биопленки обладали штаммы P. аeruginosa. Уровень биопленкообразования (OD630) для этих штаммов через 24 ч составил 0,344±0,065 ед. опт. пл. Грамположительные микроорганизмы характеризовались средним уровнем биопленкообразования. Через 48 ч уровень биопленкообразования всех исследуемых штаммов был умеренным (рис. 2).
Таким образом, среднеадгезивные штаммы, проявляя высокий уровень АЛА, интенсивнее образуют биопленки на поверхности полистирола. АЛА рассматривается как один из наиболее значимых персистентных свойств микроорганизмов, позволяющих им длительно существовать в организме хозяина [8]. Наличие данного признака у микроорганизмов, выделенных из ран пациентов с хроническим остеомиелитом, свидетельствует о патогенном потенциале возбудителей. 9-r2.jpg

Заключение

Результаты исследования позволяют с уверенностью говорить о значительной роли факторов персистенции, к которым относится и образование биопленок, в этиологии хронического остеомиелита.
Согласно полученным данным, все исследованные штаммы, выделенные из остеомиелитического очага, обладали АЛА с видоспецифической частотой проявления и интенсивностью. Наиболее выраженная интенсивность АЛА была характерна для грамотрицательных микроорганизмов. Часть штаммов S. aureus, P. aeruginosa, S. marcescens обладали высокой способностью инактивировать естественные факторы защиты организма. Высокий уровень АЛА преобладал у среднеадгезивных штаммов.
Все исследованные штаммы микроорганизмов были способны к образованию биопленки на поверхности полистирола, при этом наблюдаются различия в интенсивности ее формирования через 24 и 48 ч. Кроме того, интенсивность формирования биопленки грамотрицательными микроорганизмами выше по сравнению с грамположительными.
Исходя из результатов исследования, можно сделать вывод, что среди этиологических агентов хронического остеомиелита наибольшим патогенным потенциалом обладают штаммы P. aeruginosa.
Список исп. литературыСкрыть список
1. Ehrlich GD еt al. Antimicrob Agents Chemother 2003; 47: 317.
2. Smith AW. Biofilms and antibiotic therapy: is there a role for combating bacterial resistance by the use of novel drug delivery systems? Adv Drug Deliv Rev 2005; 29: 1539–50.
3. Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н. Микробные биопленки ран: состояние вопроса. Травматология и ортопедия России. 2011; 3: 119–25.
4. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинц-
бург А.Л. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития. Генетика. 2004; 40: 1–12.
5. Романова Ю.М., Диденко Л.В., Толорда-
ва Э.Р. и др. Биопленки патогенных бактерий и их роль в хронизации инфекционного процесса. Поиск средств борьбы с биопленками. Вестн. РАМН. 2011; 10: 31–9.
6. Честнова Т.В., Серегина Н.В. Современные представления о физико-химических особенностях существования бактерий в составе биопленок. Общественное здоровье и здравоохранение: профилактическая и клиническая медицина. XXXXV научно-практическая конференция профессорско-преподавательского состава ТулГу. Тула: ТулГУ, 2009; с. 138.
7. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий: теория и практика. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2000; 4: 4–7.
8. Салманова О.Н. Антилизоцимная активность этиологических агентов хронического травматического остеомиелита. Украiнський медичний альманах. 2004; 7 (5): 135–6.
9. Бриллис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лаб. дело. 1986; 4: 210–2.
10. Бухарин О.В., Усвяцов Б.Я., Малыш-
кин А.П., Немцева H.В. Метод определения антилизоцимной активности микроорганизмов. Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1984; 2: 27–8.
11. O´Toole GF, Kolter R. Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Mol Microbiol 1998; 30: 295–304.
12. Stepanovic S, Vuković D, Jezek P et al. Influence of dynamic conditions on biofilm formation by staphylococci. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2001; 20: 502–4.
13. Гайдышев И.П. Решение научных и инженерных задач средствами Excel, VBA и C/C++. СПб.: БХВ-Петербург, 2004.
Количество просмотров: 1032
Предыдущая статьяЭтиологическая роль и экология Staphylococcus aureus у больных специализированных отделений стационара при моно- и смешанных раневых инфекциях
Следующая статьяАнализ возбудителей инфекционного процесса у больных после эндопротезирования

Поделиться ссылкой на выделенное

Прямой эфир